พระอุโบสถ ตั้งอยู่ภายในระเบียงคด เป็น 1 ใน 3 ของอาคารหลักในเขตพุทธาวาส เป็นอาคารก่ออิฐถือปูน อาคารดังกล่าวแม้จะถูกซ่อมอยู่หลายครั้งหลังจากสมเด็จพระบวรราชเจ้ามหาสุรสิงหนาทเสด็จสวรรคต แต่รูปแบบโดยรวมคงไม่ได้เปลี่ยนแปลงมากนัก ดังปรากฏว่าการปฏิสังขรณ์ครั้งสำคัญในสมัยพระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าเจ้าอยู่หัวได้ให้รักษาแบบดั้งเดิมไว้ ซึ่งสาเหตุนั้นอาจเกี่ยวข้องกับเรื่องเล่าในพระบรมราชาธิบายในพระบาทสมเด็จพระจอมเกล้าเจ้าอยู่หัวว่า สมเด็จพระสังฆราชและพระราชาคณะได้ขอให้พระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าเจ้าอยู่หัวทรงปฏิสังขรณ์วัดมหาธาตุยุวราชรังสฤษฎิ์อยู่หลายครั้งให้ใหญ่โตงดงามคู่กับวัดพระเชตุพนวิมลมังคลราม เพราะวัดแห่งนี้เป็นที่สถิตของสมเด็จพระสังฆราช พระสงฆ์จากทุกสารทิศเดินทางไปมา พระองค์ทรงรับสั่งว่า การปฏิสังขรณ์เป็นเรื่องที่ควรทำ แต่ไม่สามารถเปลี่ยนแปลงอะไรตามพระราชหฤทัยได้ เพราะสมเด็จพระบวรราชเจ้ามหาสุรสิงหนาท ได้แช่งสาบานต่าง ๆ ไว้ จะเยื้องยักของท่านก็ไม่ได้ พระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าฯ ทรงรับสั่งอีกว่า ถ้าเจ้าคุณทั้งปวงจะให้ปฏิสังขรณ์ ขอให้พระองค์แก่ชราแล้วจึงตกกระไดพลอยโจนไปทำถวาย ด้วยเหตุนี้ภายหลังเมื่อทรงพระชนมายุครบ 60 พรรษาแล้ว จึงทรงรับสั่งให้ปฏิสังขรณ์วัดมหาธาตุยุวราชรังสฤษฎิ์ วัดชนะสงคราม และวัดอื่น ๆ ที่สมเด็จพระบวรราชเจ้ามหาสุรสิงหนาท ได้ทรงสร้างหรือบูรณปฏิสังขรณ์ไว้ ส่วนที่พระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าฯ ทรงปฏิสังขรณ์แก้ไขไว้ในส่วนพระอุโบสถ วัดมหาธาตุยุวราชรังสฤษฎิ์ คงมีเพียงทรงโปรดให้เสริมผนังและเสาพระอุโบสถสูงขึ้นกว่าเดิมหนึ่งศอก